Ile kosztuje in vitro

Realizacja informacji zawartej w DNA odbywa się we wszystkich komórkach za pośrednictwem procesu transkrypcji, to jest przepisywania informacji na drugi kwas nukleinowy — RNA. Przepisywanie nie jest prostą stratą czasu i ślepym powielaniem informacji już zawartej w DNA. Etap transkrypcji zawiera niezwykle istotny element selekcji i segregacji informacji przed jej zrealizowaniem. Musimy tylko stale pamiętać o tym, że to, co i jak wybierać z zapisu w DNA, nie wynika z immanentnych cech procesu transkrypcji lub charakteru RNA, jest to również informacja lub, jeśli kto woli, program zawarty w DNA. Zaczniemy od opisu samego zjawiska transkrypcji, by móc potem lepiej zrozumieć problemy jego regulacji. Mówiąc o transkrypcji, czyli przepisywaniu informacji z DNA na RNA, trzeba od razu zaznaczyć, że chociaż podstawowe jej zasady są podobne u pro- i eukariontów, złożoność zjawisk towarzyszących transkrypcji eukariotycznej jest o wiele większa. Podczas transkrypcji DNA ulega miejscowemu rozpleceniu, a jedna z jego nici zostaje przepisana (transkrybowana) w nić RNA, przy udziale enzymu zwanego polimerazą RNA. Enzym ten działa podobnie jak polimeraza DNA, z tym jednak, że katalizuje łączenie się rybonukleotydów, a nie dezoksyrybonukleotydów. Matrycą jest oczywiście przepisywana nić DNA. Czynnik sigma pełni funkcję podjednostki rozpoznającej miejsce wiązania polimerazy do DNA. Inne czynniki białkowe związane są prawdopodobnie z terminacją transkrypcji.

Zatrzymanie replikacji jest sygnałem SOS, który indukuje powstanie w komórce nowego typu polimerazy. Ta nowa polimeraza, nie mogąc dobudowywać nukleotydów według matrycy, dobudowuje je w tym miejscu na chybił trafił, przypadkowo. Oczywiście tylko do miejsca, od którego może się znowu zacząć replikacja według istniejącej matrycy. Przypadkowe wstawianie nukleotydów — byle tylko zapewnić ciągłość nici, jest związane z powstaniem trwałej mutacji. Poreplikacyjna naprawa pierwotnego uszkodzenia chemicznego będzie polegać na użyciu nowo stworzonej nici jako matrycy. Mimo iż mutacje wprowadzone przez naprawę SOS mogą teoretycznie spowodować śmierć komórki, stanowią one dla niej niewątpliwie mniejsze zło niż przerwanie replikacji. Mutacje są źródłem zmienności na poziomie DNA. Stanowią praktycznie jedyne źródło nowych układów zasad w DNA, testowanych następnie w trakcie ewolucji. Mutacje punktowe oraz mutacje związane z systemem naprawczym DNA odgrywają zasadniczą rolę nie tylko w długotrwałych procesach ewolucyjnych. Wydaje się bardzo prawdopodobne, że mają również udział w procesach starzenia się organizmów oraz indukcji nowotworów.

Użycie znakowanych radioaktywnością aminokwasów pozwoliło wykazać, że procesy biosyntezy białka — ten największy dotąd sekret żywej komórki — można bez większych trudności badać w zwyczajnej szklanej probówce. Wystarczy w tym celu rozbić komórki bakterii Escherichia coli i do uzyskanego ekstraktu bez- komórkowego dodać aminokwasów (wśród nich radioaktywnych) oraz związku zawierającego wiązanie wysokoenergetyczne, by obserwować wbudowywanie się piętna radioaktywnego do białek. Ekstrakt z Escherichia coli, nazywany też często układem bezkomórkowym, zawiera rybosomy, bakteryjny mRNA, różne tRNA oraz pewne enzymy konieczne do funkcjonowania aparatu biosyntezy. Po wyczerpaniu się własnego mRNA system może funkcjonować również na mRNA dodanych z zewnątrz. Po translacji zsyntetyzowany peptyd ulega często dodatkowej obróbce, zanim tanie się właściwym, funkcjonalnym białkiem komórkowym. Oprócz wspomnianego już usuwania początkowej N-formylometioniny następować może enzymatyczne wycinanie całych fragmentów łańcucha peptydowego. Na przykład znany hormon peptydowy trzustki — insulina, syntetyzowany jest jako tak zwana proinsulina, forma nieaktywna fizjologicznie. Dopiero potranslacyjne wycięcie określonego fragmentu łańcucha daje aktywną fizjologicznie insulinę. Niektóre aminokwasy wchodzące w skład białek ulegają już po translacji modyfikacjom poprzez enzymatyczne dołączenie niewielkich grup bocznych, na przykład grupy hydroksylowej — OH.

Ustalenie budowy DNA i odcyfrowanie kodu genetycznego umożliwiło określenie na poziomie molekularnym podstawowej relacji między genem a cechą, między genotypem a fenotypem. Sens molekularny procesu rozmnażania stał się również jasny, ponieważ dowiedzieliśmy się, że wierne odtwarzanie całych organizmów jest ściśle związane z wiernym odtwarzaniem ich DNA. Proces replikacji DNA stanął więc w centrum uwagi biologów. Drugi proces, równie jak replikacja ważny dla ewolucji życia na Ziemi, to powstawanie i utrwalanie się zmian w DNA. Podczas gdy autoreplikacja dąży do odtworzenia informacji bez zmian, ten drugi proces dąży do modyfikacji informacji. Bez tych dwóch antagonistycznych procesów, zachodzących w określonym środowisku Ziemi, nie byłaby możliwa ewolucja żywej materii. Do zreplikowania macierzystej cząsteczki DNA wystarczy, by tworzące ją dwie nici komplementarne rozdzieliły się, a każda z nich dobudowała nić potomną komplementarną do siebie samej. W sensie fizycznym, w modelu takim nie można wyróżnić DNA rodzicielskiego i DNA potomnego. Każda podwójna spirala DNA zawiera bowiem po jednym starym i po jednym nowym łańcuchu. Patrząc na to tylko w ten sposób można odnieść wrażenie, że cząsteczka DNA jest nieśmiertelna. Oczywiście, w przypadku organizmów wyższych odnosiłoby się to wyłącznie do DNA linii komórek płciowych, a dokładniej tych, które miały szczęście stać się zygotą, to jest zapłodnioną plemnikiem komórką jajową, dającą początek nowemu organizmowi. Już od tego momentu jednak nie ma żadnej pewności, że przekazana z poprzedniego pokolenia nić DNA wejdzie również do linii komórek płciowych. Zauważmy, że tego rodzaju system, gdyby istniał, zgodny byłby z modelem „plazmy zarodkowej” Weismanna.

Mimo niepotwierdzenia się szczegółów hipotezy Gamowa idea w niej zawarta okazała się niezwykle płodna. Warto uzmysłowić sobie, na czym polegała przede wszystkim jej doniosłość. Chodziło tu raz jeszcze o przełamanie antyredukcjonistycznego nastawienia biologów. Nastawienie to streszczało się w poglądzie: jeżeli już DNA ma być prostą i monotonną strukturą chemiczną, to niech przynajmniej mechanizm kodowania informacji genetycznej oparty będzie na tak zwanej zasadzie biologicznej. Gamow natomiast proponował rozwiązanie, w mniemaniu wielu biologów, na miarę niedzielnej łamigłówki gazetowej lub w najlepszym razie usprawnionego kodu Morsea. To, że idea Ga- mowa okazała się w końcu prawdziwa, świadczy, że natura nie stroni od rozwiązań prostych. Współodkrywca struktury DNA, Francis Crick, zaproponował pewną bardzo istotną modyfikację koncepcji Gamowa. Modyfikacja ta zawarta była w podanej przez Cricka „hipotezie adaptorowej”. Odrzucała ona zakładaną poprzednio konieczność bezpośredniego oddziaływania między zasadami DNA a aminokwasami. Zamiast tego Crick postulował istnienie adaptorów, czyli cząsteczek pośredniczących w przenoszeniu informacji między DNA a białkiem. Właściwości adaptorów musiały obejmować z jednej strony zdolność do rozpoznawania odpowiedniego słowa zapisanego w języku zasad, z drugiej zaś — zdolność przyłączania odpowiedniego aminokwasu. Przy takim założeniu odpada konieczność dopasowania długości kodonu w DNA i odpowiadającego mu aminokwasu.

Model ten został udowodniony eksperymentalnie przez Matthew Meselsona i Franklina Stahla w niezwykle pomysłowym doświadczeniu, w którym dla oznaczenia nowo powstających nici użyto prekursorów DNA z wbudowanym ciężkim izotopem azotu 15N. Doświadczenie Meselsona i Stahla było pierwszym potwierdzeniem doświadczalnym w układzie biologicznym słuszności modelu DNA opublikowanego przez Watsona i Cricka. Niewiele później biochemik amerykański, Artur Kornberg, udowodnił, że synteza DNA jest procesem enzymatycznym, który polega na kopiowaniu nici-matrycy. Jednak problem syntezy DNA wcale się tu nie kończy, choć praca Kornberga była w nim niewątpliwie krokiem milowym. Odkryty przez niego wówczas enzym — polimeraza DNA — okazał się w rzeczywistości odpowiedzialny za naprawę uszkodzeń w DNA, a nie za właściwą replikację. W tym ostatnim procesie decydujące okazały się innego rodzaju polimerazy, zdolne do kopiowania matryc DNA. Dzisiaj wiemy, że sam proces replikacji jest znacznie bardziej złożony niż początkowo przypuszczano. Zaangażowanych jest w nim co najmniej kilkanaście różnych białek oprócz samej kopiującej DNA polimerazy. Tego rodzaju rozwój sytuacji jest bardzo charakterystyczny dla postępu nauki. Najpierw następuje zwykle ustalenie idei procesu, jego podstawowych zasad. W przypadku biochemii replikacji ta idea to zasada enzymatycznego łączenia się nukleotydów ustawiających się wzdłuż nici-matrycy według reguł komplementarności.

RNA jest kwasem rybonukleinowym zawierającym podobnie jak DNA pięciowęglowy cukier, resztę kwasu fosforowego i cztery zasady azotowe, z tym, że zamiast tyminy występuje tu uracyl tworzący, podobnie jak tymina, komplementarną parę z adeniną, zaś cukier jest rybozą nie zaś dezoksyrybozą, jak w DNA. RNA jest też w przeciwieństwie do DNA jedno-, a nie dwuniciowy. Znaleziony w cytoplazmie RNA, nazwany później transportującym, mógł przyłączać do jednego ze swych końców aminokwas. W przeciwległym rejonie cząsteczki znajdowała się natomiast eksponowana trójka nukleotydów, stanowiąca tak zwany antykodon, który był w stanie rozpoznawać kodon właściwy dla przyłączonego do tRNA aminokwasu. Wykrycie tRNA stanowiło wspaniałe potwierdzenie słuszności postulatów hipotezy adaptorowej. Okazało się, że każdy aminokwas ma swój własny, specyficzny tRNA. Bardzo ważnym odkryciem było również wykazanie, że bezpośrednim nośnikiem informacji genetycznej oddziaływającym z tRNA jest inny rodzaj kwasu rybonukleinowego, również obecny w cytoplazmie, dla którego J. Monod i F. Jacob z Instytutu Pasteura w Paryżu zaproponowali nazwę: RNA informacyjny — mRNA od angielskiego messenger RNA. Tak jak wszystkie rodzaje RNA, mRNA syntetyzowany jest na matrycy jednej z nici DNA. Stanowi zatem dokładną, komplementarną kopię zapisu w DNA. Przepisywanie informacji z DNA na mRNA, czyli tak zwana transkrypcja, jest procesem enzymatycznym, katalizowanym przez enzym: polimerazę RNA. Procesem transkrypcji zajmujemy się szczegółowo nieco dalej. Mimo iż jego zasada: przepisywanie z DNA na RNA jest prosta, relacja między DNA, transkrypcją i syntezą białek zawiera wiele złożonych elementów związanych głównie z regulacją tych procesów.

Jeżeli w DNA znaczenie mają poszczególne trójki, to rozpoczęcie czytania odcinka od pierwszej litery daje zupełnie inny zestaw słów niż ten, który powstanie, gdy czytanie rozpoczniemy od drugiej litery. Ponieważ struktura DNA jest całkowicie regularna, a jednocześnie sekwencja zasad zupełnie dowolna, nic nie nadaje się w nim do pełnienia roli przecinków. Z tego powodu od początku właściwie zakładano, że kod jest bezprzecinkowy, ma natomiast zawsze ustalony początek czytania. Na przełomie lat pięćdziesiątych i sześćdziesiątych Francis Crick, Sidney Brenner i ich współpracownicy wykonali w Cambridge serię bardzo pomysłowo zaplanowanych doświadczeń genetycznych, które pozwoliły na ustalenie ogólnych właściwości kodu. Informacja genetyczna odczytywana jest od pojedynczego, ustalonego punktu w ugrupowaniach zasad, które nie nakładają się na siebie — zatem kod jest nie nakładający się. Poszczególne słowa kodu są stałej wielkości i zawierają najprawdopodobniej po trzy zasady — jest to zatem jednolity kod trójliterowy. Trójki nonsensowne, to jest nie kodujące aminokwasów, zdarzają się stosunkowo rzadko. Większość spośród 64 możliwych trójek koduje aminokwasy. Innymi słowy musi się zdarzać, że niektóre aminokwasy kodowane są w DNA przez więcej niż jedną trójkę — tego rodzaju cechę Crick zaproponował nazwać zdegenerowaniem kodu. Początek lat sześćdziesiątych przyniósł zasadniczy przełom w biochemicznych badaniach nad mechanizmem przekazywania informacji genetycznej i nad kodem. Z chwilą ugruntowania się poglądu, że nie istnieje bezpośrednie «oddziaływanie między DNA a aminokwasami, rozpoczęto poszukiwanie cząsteczek pośredniczących, postulowanych przez Cricka.

Zamiana jednego aminokwasu w białku, szczególnie zamiana na aminokwas o podobnym charakterze chemicznym, może odbić się tylko nieznacznie lub wcale na aktywności biologicznej białka. W przypadku enzymów zmiany w centrum aktywnym mają oczywiście inną wagę niż zmiany w pozostałej części cząsteczki. Typowym przykładem mutacji polegających na zamianie zasad są zamiany pojedynczych aminokwasów w hemoglobinie ludzkiej, wykryte w różnych miejscach kuli ziemskiej. Nietrudno zauważyć, że zmiany powodowane przez tego rodzaju mutacje mogą się nagromadzać w DNA. Jedną z typowych zmian powodowanych w DNA przez czynniki mutageniczne jest powstawanie nowych wiązań kowalencyjnych między zasadami pod wpływem promieniowania ultrafiołkowego. Dimer pirymidynowy uniemożliwia prawidłowe parowanie się zasad. Podczas replikacji takiego miejsca nastąpiłby w nim nieuchronnie błąd w kopiowaniu matrycy zawierającej dimer. Usunięcie dimeru nastąpić może albo dzięki tak zwanej reakcji foto- reaktywacji (np. w komórkach skóry), podczas której enzym zwany fotoliazą rozczepia, pod wpływem światła widzialnego, dimery z powrotem do monomerów, albo też, pod nieobecność światła, w procesach tak zwanej reperacji ciemnej. O ile fotoreaktywacja naprawia zwykle efekty fotochemicznego sprzężenia pirymidyn, o tyle procesy reperacji ciemnej naprawiają oprócz tego również zmiany powstałe w łańcuchu DNA pod wpływem mutagenów chemicznych. Tych ostatnich jest bardzo wiele, a każdy rok działalności gospodarczej człowieka wydatnie zwiększa ich stężenie w atmosferze i hydrosferze ziemskiej.