Ile kosztuje in vitro

Represor jest cząsteczką białka zdolną do oddziaływania z dwoma zupełnie różnymi substancjami. Jedno miejsce represora rozpoznaje unikalną sekwencję w DNA, czyli operator, drugie miejsce natomiast rozpoznaje i wiąże się ze związkiem drobnocząsteczkowym. W przypadku tzw. operonu laktozowego tym ostatnim jest pochodna dwucukru laktozy. Jeżeli jeszcze uświadomimy sobie, że represor jest białkiem podjednostkowym — jasna stanie się analogia między mechanizmem represji a sposobem funkcjonowania enzymów allosterycznych. Oddziaływanie między represorem a cząsteczką indukującą jest odwracalne. Zatem przy obniżeniu stężenia induktora represor odzyskuje zdolność wiązania się z operatorem. Inny typ represora działa w przypadku hamowania syntezy enzymów przez produkt szlaku reakcji enzymatycznych. Sam represor nie ma zdolności wiązania się z operatorem, natomiast gdy związany jest z cząsteczką stanowiącą ostateczny produkt reakcji, wiąże się z operatorem i hamuje transkrypcję. Układ trzech rodzajów genów, który tu opisaliśmy, nosi nazwę operonu. W genomie bakterii wiele genów regulowanych jest w systemie operonowym. Dzisiaj znamy już budowę niektórych represorów i sekwencję miejsc operatorowych. Umożliwia to bezpośrednie badanie mechanizmu oddziaływania DNA i białka regulatorowego, co ma znaczenie nie tylko w odniesieniu do bakterii, ale również wszystkich pozostałych organizmów żywych. Poznany u bakterii proces transkrypcji obejmujący transkrypcję konstytutywną i regulowaną w systemie operonów, mimo iż nie wyjaśnia do końca regulacji funkcji genów prokariotycznych, daje nam w sumie dość dobrą orientację w ogólnym charakterze związków między formą morfologiczną i warunkami życia a aktywnością genów tych najprostszych organizmów. O wiele mniej jasno przedstawia się sprawa w przypadku organizmów bardziej złożonych — eukariontów.

Obok fuzji komórek, w czasie której dochodzi do połączenia się całych genomów, przeprowadza się również transformację za pomocą wyizolowanego DNA. Procedura transformacji pozwala na wniknięcie do komórki biorcy tylko niewielkich fragmentów genomu dawcy, zawierających co najwyżej kilkanaście genów. Ponieważ zarówno fragmentacja dłuższych odcinków DNA, jak i rodzaj pobranego przez komórkę fragmentu są w zasadzie wydarzeniami losowymi, pierwsze doświadczenia z transformacją dawały wyniki zupełnie przypadkowe. Ulepszenie metody transformacji komórek stanowiło właściwy początek rozwoju dziedziny, którą dzisiaj nazywamy inżynierią genetyczną. Postęp dotyczył przede wszystkim metody kontrolowania fragmentacji DNA. Zwykle bardzo trudno jest uzyskać z komórek DNA w stanie całkowicie nienaruszonym. Ze względu na wielkość cząsteczek ulega on przede wszystkim degradacji mechanicznej. Długie włókna DNA pękają łatwo w czasie wydmuchiwania roztworu z pipety, zbyt energicznego mieszania itp. Kolejnym niebezpieczeństwem są obecne zawsze w tkankach enzymy trawiące DNA — nukleazy. Uwolnione z komórek podczas homogenizacji atakują i przecinają DNA. Zanim więc rozpocznie się kontrolowaną fragmentację DNA, którą notabene przeprowadza się również za pomocą nukleaz, tylko specjalnie dobranych, trzeba mieć pewność, że wyizolowany preparat jest w minimalnym stopniu uszkodzony. Dostarczanie komórkom bakteryjnym pofragmentowanego w sposób kontrolowany DNA z wybranego źródła, jako materiału do transformacji, można wprawdzie uznać za udział człowieka w konstruowaniu nowych kombinacji genowych jednak jest wciąż kwestią przypadku, które fragmenty bakteria pobierze. Nie jest to więc jeszcze inżynieria genetyczna w pełnym tego słowa znaczeniu.

Materiał genetyczny wirusa stanowi przecież ze względu na dołączony do niego represor barierę dla normalnej transkrypcji gospodarza zachodzącej w tym odcinku chromosomu. Przerywając ciągłość transkrypcji i zmuszając do zaczęcia jej od nowego miejsca, prowirus wpływa na tworzenie nowych, nienaturalnych jednostek transkrypcyjnych. Rzecz to wcale nie obojętna dla komórki, może bowiem prowadzić do zasadniczej zmiany sposobu jej funkcjonowania. Jest wielce prawdopodobne, że efekty takie mogą mieć groźne następstwa dla organizmu, w skład którego wchodzi komórka. Wystarczy na przykład, by nowy system zorganizowania transkrypcji powodował uaktywnienie poprzednio zablokowanego w zróżnicowanej już komórce systemu replikacji. Z drugiej strony, w długiej historii ewolucji na Ziemi wstawki z genów wirusowych mogły się nieoczekiwanie okazywać bardzo przydatne dla gospodarza, stanowiąc dlań świeży materiał w korzystny sposób uzupełniającyjego własne geny. Ta ostatnia idea ma wśród biologów coraz więcej zwolenników. Uważają oni, że wstawki genów do funkcjonujących chromosomów zdarzały się często w ewolucji i przyczyniały się w istotnej mierze do wzbogacenia ich zawartości informacyjnej. To wzbogacenie dotyczyło nie tylko bezwzględnej liczby genów, ale i nowych kombinacji ich liniowego ułożenia na chromosomie. Oczywiście koncepcja ta nie wyklucza bynajmniej doraźnie niekorzystnego efektu wstawek, który opisaliśmy poprzednio. Źródłem wstawek chromosomowych mogły być nie tylko infekujące komórki wirusy, ale również fragmenty innych chromosomów i przypadkowo pobierane do komórki fragmenty DNA. System wstawek DNA, zwanych również insercjami, znamy już dość dobrze u prokariontów.

Największe znane wirusy mogą zawierać w swoim DNA od 200 do 300 genów. Jak na skromne wciąż możliwości analityczne biologii molekularnej są to już bardzo skomplikowane układy. Wirusy średniej wielkości, np. bakteriofag lambda lub T4, zawierają po kilkadziesiąt genów. Zupełnie małe wirusy, np. należące do DNA-wirusów 0X 174 i FI, zawierają do kilkunastu genów. Jeszcze mniejsze od nich są to najmniejsze z dotychczas poznanych wirusów — bakteriofagi zawierające RNA, i np. R17, F2, QB. Ich RNA liczy niewiele ponad 3000 nukleotydów, a więc wystarcza do zakodowania zaledwie 4—5 białek średniej wielkości. Wystarczy porównać tę liczbę z około 5000 genów (jest to przybliżony szacunek) znajdujących się w genomie bakterii Escherichia coli| by zdać sobie sprawę z tego, jak bardzo ograniczona jest zawartość informacyjna tych struktur. Białkowe otoczki wirusów, zwłaszcza małych wirusów, składają się zwykle z niewielu rodzajów białek. Jest to oczywisty wymóg wirusowej ekonomii. W kwasie nukleinowym wirusa nie ma. po prostu miejsca na zakodowanie większej różnorodności białek. Otoczki wirusowe budowane są więc z wielu kopii kilku podstawowych podjednostek białkowych. Białka te muszą oczywiście ściśle do siebie pasować, co więcej — właściwie rozpoznawać jedno drugie tak, by sekwencja ich aminokwasów z góry determinowała specyficzne tworzenie z podjednostek właściwej struktury otoczki.

Zbadanie całkowitej sekwencji zasad w DNA wirusa pozwoliło ustalić relacje pomiędzy odcinkami kodującymi poszczególne białka. Tak więc białko określone jako D kodowane jest przez sekwencję zaczynającą się od nukleotydu 390 i kończącą się na nukleotydzie 848. W tym samym odcinku od nukleotydu 568 rozpoczyna się sekwencja dla białka E, która kończy się na pozycji 843. Podobnie matryca dla białka A zaczyna się od nukleotydu 3673, przechodzi przez końcowy na mapie nukleotyd 5375 i kończy się na nukleotydzie 136. Matryca dla białka B zaczyna się natomiast od pozycji 5063 i kończy się na pozycji 51. Dane te pozwoliły nareszcie wyjaśnić zagadkę polegającą na tym, że liczba nukleotydów wyliczona z ilości aminokwasów wszystkich znanych białek 0X 174 przewyższała całkowitą liczbą nukleotydów w DNA faga. Przykład 0X 174 pokazuje, jak zasadnicza dla stabilności wirusa w przyrodzie jest górna granica jego wymiarów. Przy okazji przekonaliśmy się raz jeszcze, że Natura ma niewielki szacunek dla praw, reguł i definicji, za pomocą których usiłujemy ją poszufladkować. Wciąż jeszcze nie wiemy, czy geny kodujące więcej niż jeden polipeptyd występują wyłącznie w świecie małych wirusów, czy też spotkamy je kiedyś również i w organizmach komórkowych. Każdy wirus ma swój cykl rozwojowy. Cyklem namnażania się wirusa nazywa się okres w jego historii od wniknięcia do komórki gospodarza aż do opuszczenia jej w postaci wielokrotnych kopii. Na ogół komórka ginie w wyniku dopełnienia się tego cyklu. Z chwilą wniknięcia do wrażliwej komórki gospodarza kwas nukleinowy wirusa zaczyna pełnić swoje funkcje matrycy. Jeżeli jest to DNA, ulega on zarówno replikacji — w celu wytworzenia potomnych cząsteczek wirusowego DNA — jak i transkrypcji.

Wspominaliśmy już, że jeden z najważniejszych etapów regulacji procesów komórkowych zachodzi na poziomie transkrypcji. Regulacja ta obejmuje cykl procesów od przepisania informacji z DNA aż do wyprodukowania cząsteczki mRNA mogącej służyć w translacji. Wiemy już, że DNA niesie w sobie informację zawartą w genach struktury oraz w genach regulatorowych. Informacja genów struktury nie zawsze wykorzystywana jest non stop. Gdyby tak było, to jest gdyby w komórce powstawały bez przerwy i z jednakową szybkością wszystkie kodowane w jej DNA białka, geny regulatorowe nie miałyby czego regulować. Liczba białek każdego typu byłaby jednakowa bez względu na potrzeby. Tak jednak nie jest. Realizację informacji w DNA komórkowym można w wielkim uproszczeniu porównać do czytania książki w miejscach, w których tkwią zakładki. Problem regulacji transkrypcji, jak zresztą wiele innych podstawowych problemów biologii molekularnej, zbadany został najlepiej w bakteriach. Wiemy już dlaczego. Bakterie stanowią po pierwsze układ niepomiernie prostszy od eukariontów, po drugie są materiałem umożliwiającym precyzyjną analizę genetyczną. Trzeba się jednak od razu zastrzec, że niezwykle interesujące mechanizmy regulacyjne, poznane już u bakterii, najprawdopodobniej nie mają równie podstawowego znaczenia w regulowaniu transkrypcji w organizmach jądrowych.

Wirus nie namnażający się, lecz egzystujący w komórce, przekazywany jest z pokolenia na pokolenie, nie powodując zwykle żadnych objawów infekcji wirusowej. Fakt nieinfekcyjnego przekazywania wirusów zawartych w komórkach rodzicielskich w postaci nazwanej prowirusem udowodniony został przekonywająco już na początku lat pięćdziesiątych, głównie dzięki pracom André Lwoffa i jego współpracowników w Instytucie Pasteura w Paryżu. Mówi się często, że prowirus istnieje w stanie lizogenicznym, co oznacza, że może w każdej chwili powrócić do normalnego cyklu namnażania kończącego się lizą, czyli rozpadem komórki. Stwierdzono ponad wszelką wątpliwość, że wśród czynników powodujących przebudzenie prowirusa znajdują się między innymi: promieniowanie nadfiołkowe, promieniowanie X i związki. chemiczne znane jako karcynogenne. W jaki sposób prowirus egzystuje w komórce? Okazało się, że włącza się on do chromosomu gospodarza, często w ściśle określonych miejscach, jako rodzaj wstawki. Chromosom replikuje się, replikując jednocześnie kwas nukleinowy wirusa, który zachowuje się jak jego integralna część. Wstawienie wirusowego DNA do genomu gospodarza jest procesem enzymatycznym, za który odpowiedzialne są prawdopodobnie enzymy wytworzone uprzednio według zapisu w matrycach wirusowych. Włączony do genomu DNA wirusa nie ulega normalnej transkrypcji. Kilka z jego genów ulega jednak ekspresji.

Wirusy można scharakteryzować określeniem „małe nie zawsze znaczy proste”. Są one oczywiście bardzo małe, ale poszczególne ich typy różnią się od siebie znacznie wielkością, która waha się od masy cząsteczkowej kilku milionów, co odpowiada dosłownie kilku makrocząsteczkom, aż do tworów o wielkości małych bakterii, zawierających wieleset makrocząsteczek. Wirusy nie mają ani normalnej błony, ani aparatu syntezy białka, ani aparatu enzymatycznego służącego do syntezy metabolitów. Złożone są z kwasu nukleinowego osłoniętego ochronną warstwą białkową. Osłonka zawiera u niektórych wirusów również węglowodany i lipidy. Kwas nukleinowy stanowiący rdzeń wirusa to albo DNA (u tzw. DNA-wirusów), albo RNA (u tzw. RN A-wirusów). Kwas nukleinowy każdego wirusa zawiera niewielki, ale dobrze sprawdzony w ewolucji zestaw genów. Wirus to zatem jak gdyby wędrująca swobodnie w przyrodzie, opakowana przesyłka genowa. Oczywiście wirusy są pasożytami. Mogą się rozmnażać tylko wewnątrz komórki gospodarza, korzystając z jej stałego środowiska, enzymów, aparatu biosyntezy białka i produkowanych przez nią substratów metabolicznych. Człowiek traktuje zwykle wirusy jako uciążliwy dla ludzkości wynalazek przewrotnej Natury, powodujący rozliczne i trudne do zwalczenia choroby nie tylko u ludzi, ale również u roślin i zwierząt. Wywoływanie przez wirusy niektórych chorób nowotworowych jeszcze bardziej wzmaga ten negatywny do nich stosunek. Z punktu widzenia Natury, jeśli o takim możemy mówić, wirusy są integralną częścią zjawiska życia. na Ziemi.

Analiza genetyczna różnych organizmów wykazuje, że w DNA niosącym sensowną informację, zarówno u pro-, jak i eukariontów, oprócz tak zwanych genów struktury, które kodują białka, oraz genów kodujących RNA rybosomalny i tRNA, zawarte są tak zwane geny regulatorowe, decydujące kiedy i w jakich zestawach odczytywane mają być geny struktury. Oczywiście, zarówno geny struktury, jak i regulatorowe ulegają zmianom w ewolucji. Bardzo duże zmiany, skoki w ewolucji wymagają niewątpliwie nabycia nowej informacji genetycznej. W przeciwieństwie do tego jednak, zróżnicowanie ewolucyjne i specjalizacja zachodzące między ściśle spokrewnionymi grupami systematycznymi osiągane są prawdopodobnie raczej w drodze zmiany w użyciu zasadniczo tej samej informacji genetycznej. Ponieważ podstawowe procesy biochemiczne leżące u podłoża życia są podobne u wszystkich organizmów, reakcje metaboliczne, szczególnie w grupach blisko spokrewnionych, takich jak np. kręgowce, muszą generalnie zależeć od tego samego rodzaju genów, wyrażonych w postaci specyficznych enzymów i innych białek. Białka z różnych gatunków, homologiczne pod względem pozycji zajmowanej w metabolizmie, mogą różnić się nieco składem aminokwasowym, lecz ich zasadnicze właściwości biochemiczne i keje metaboliczne pozostają te same. To co odróżnia jednego kręgowca od drugiego, to przede wszystkim inne czasy uruchamiania i różnice w ilości produktów zasadniczo podobnych genów struktury, nie zaś nieznaczne różnice w budowie tych produktów.

Zduplikowanie funkcjonującego już genu stwarza obszar mutacji niezależny w stosunku do genu pierwotnego. Ponieważ mutacje są przypadkowe, dwa na początku identyczne geny mogą mutować w różnych miejscach, a co za tym idzie ewoluować w różnych kierunkach. Jeżeli oba geny będą ulegały ekspresji, to jest według zawartego w nich zapisu syntetyzowane będą białka, dobór naturalny może doprowadzić do ich całkowitego zróżnicowania, tak że po upływie określonego czasu staną się one dwoma zupełnie różnymi genami. Ten sposób tworzenia genu, a więc przez zmianę sprawdzonej już uprzednio i funkcjonującej sekwencji, zabiera niewątpliwie mniej czasu niż wspomniane na początku utworzenie funkcjonalnej jednostki z odcinka o całkowicie przypadkowej sekwencji. W DNA występują również tak zwane sekwencje palindromowe. Palindrom to sekwencja liter lub słów czytających się tak samo w obie strony, jak np. słowo KAJAK lub zdanie: „Kobyła ma mały bok”. Sekwencje zasad ułożone w palindromy okazały się dość częste w DNA zarówno u pro-, jak i eukariontów. W przypadku dwuniciowego DNA palindrom oznacza rejon DNA odznaczający się podwójną symetrią obrotową. Obecność palindromów w cząsteczce jednoniciowego tRNA umożliwia powstawanie rejonów dwuniciowych nadających określoną strukturę przestrzenną. Z drugiej strony symetria palindromowej sekwencji w dwu- niciowym DNA stanowi idealne miejsce oddziaływania z białkami, których struktura przestrzenna zawiera element odpowiadającej symetrii, np. symetryczne ułożenie pod jednostek.